Diagnostik

Sequenzierung von SARS-CoV-2

 Echo 525 Acoustic Liquid Handler (links) und daneben die Echo ADE-Technologie (akustische Tröpfchendispensierung). Durch Schallwellen werden kontaktlos und präzise Tropfen von der Quell-Mikrotiterplatte auf die darüber positionierte Ziel-Mikrotiterplatte dispensiert (acoustic droplet ejection). Bildnachweis: FRY Laboratories, LLC


Die SARS-CoV-2-Pandemie hat sowohl in den Vereinigten Staaten als auch international zu erheblicher Morbidität und Mortalität geführt, was mit einer erheblichen Unterbrechung der Wirtschaftstätigkeit einherging.

Ein flächendeckendes und wirtschaftliches SARS-CoV-2-Screening ist ein Eckpfeiler zur Wiederherstellung der heimischen Wirtschaftsproduktion und der globalen Gesundheit. Fry Laboratories hat einen Hochdurchsatztest unter Verwendung der Illumina MiSeq DNA-Sequenzierungsplattform entwickelt und validiert. Mit dieser Methode kann jeder Illumina MiSeq 1.152 Proben mit einer Laufzeit von vier Stunden pro Sequenzierer verarbeiten. Ermöglicht wird dies durch einen innovativen Ansatz, bei dem die SARS-CoV-2-Targets N1, N2, N3 und die menschliche RNAse P für die schnelle DNA-Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) gleichzeitig reverse-transkribiert, amplifiziert, barcodiert und angepasst werden. Die Zusammenstellung der komplexen und kritischen PCR-Reaktionen für diesen Assay ist entscheidend für die Leistung und die Kosteneffizienz des Assays. Der Echo 525 Liquid Handler unterstützt die Skalierbarkeit, Effizienz und Kosteneffizienz und bietet erhebliche Einsparungen, die Engpässe reduzieren, die die Akzeptanz dieses Protokolls beeinflussen können. Die Fähigkeit des Echo Liquid Handlers, von jedem Well aus in ein anderes Well zu dispensieren, kann auf jedes öffentliche und private Labor übertragen werden, das ähnliche amplikonbasierte Assays verwendet.


Während der PCR-Assemblierung und der Probenpooling-Schritte wurden erhebliche Zeiteinsparungen von ~60 % erzielt. Die Verringerung der Reaktionsvolumina sowie die Tatsache, dass die Technologie ohne Pipettenspitzen auskommt, ermöglichen erhebliche Kosteneinsparungen von ~50 % bei Mastermix und Einwegpipettenspitzen. Darüber hinaus wurden durch den Einsatz des Echo 525 Verbesserungen in der Assay-Leistung beobachtet, insbesondere hinsichtlich der Verringerung falsch positiver Ergebnisse. Das hier gezeigte Beispiel und die akustische Liquid-Handling-Technologie sind ein Präzedenzfall für künftige komplexe molekulare Assays, nicht nur für den Nachweis von SARS-CoV-2 mittels NGS.
Fry Laboratories entschied sich für den Echo 525 Acoustic Liquid Handler, um den Aufbau einer skalierbaren, komplexen Multiplex-PCR-Reaktion zu unterstützen. Dabei verglich das Labor seinen bestehenden Standard-SARS-CoV-2-NGS-Detektionsassay mit einem leicht modifizierten Protokoll, das die Miniaturisierung und die "Any-well-to-any-well"-Dispensierfähigkeiten des Echo 525 Liquid Handlers nutzt. Zusätzlich zu den unmittelbaren Zeit- und Spitzeneinsparungen war das Labor in der Lage, Reaktionen direkt aus konzentrierten Primer-Beständen zusammenzustellen und dadurch das gesamte Reaktionsvolumen und den Reagenzienverbrauch zu reduzieren. Diese Vorteile wurden ohne signifikante Auswirkungen auf die Assay-Leistung realisiert und innerhalb von zwei Wochen nach der Installation des Echo Liquid Handler eingeführt.


Insgesamt hat der Echo Liquid Handler zu mehreren bedeutenden und signifikanten Verbesserungen geführt:

  • Dispensieren hochkonzentrierter Stock-Oligos: Das Dispensieren von 25 nL hochkonzentrierter Oligos direkt aus den Stocks (effektiv 0 Volumen) ermöglicht ein effizienteres Verhältnis von Template zu Gesamtvolumen.
  • Kürzere Zeit für den Reaktionsaufbau: > 60 % Reduzierung (45 Minuten für einen vollständigen Lauf gegenüber zwei Stunden mit vorgepoolten Oligos). Würden die Reaktionen direkt aus den Oligostämmen zusammengesetzt, wie es beim Echo Liquid Handler der Fall ist, würden schätzungsweise 40-50 Stunden manuelle Arbeit erforderlich sein.
  • Geringerer Verbrauch an Reagenzien: 50 % weniger Verbrauch an Mastermix (5 μL statt 10 μL)
  • Unmittelbare Einsparungen beim Spitzenverbrauch: Mehr als 4.500 Spitzen pro Lauf werden eingespart.
  • Einfaches Dispensieren komplexer Mischungen: Durch die Verwendung des Echo-Picklist--Formats konnte das Labor innerhalb von zwei Tagen nach der Installation erste Tests mit dem Echo einrichten und durchführen und einen Print-on-Demand Arbeitsablauf einrichten.
  • Pooling von Sequenzierbibliotheken: Das Pooling von Bibliotheken auf Nanoliter-Ebene reduziert die Variabilität der Probe zu Probe-Präzision, reduziert den Verbrauch seltener Amplikons und ermöglicht eine präzisere Qualitätskontrolle und Probenarchivierun 

 

Proben- und Arbeitsablaufübersicht für den SARS-CoV-2 NGS-Assay

 

Fazit

Der Echo 525 Acoustic Liquid Handler ist unübertroffen, wenn es darum geht, miniaturisierte Amplifikationsreaktionen in skalierbarer Weise vorzubereiten. Mit dem Echo 525 können Reaktionen in Minuten zusammengestellt werden, die sonst Stunden oder Tage dauern würden, und zwar direkt aus Primern in Stammkonzentrationen. Diese Möglichkeit der Vorbereitung von PCR-Reaktionen ohne Spitzen ist entscheidend für die Beseitigung von Durchsatzengpässen bei dem SARS-CoV-2-Assay von Fry Laboratory. Die Implementierung des Echo 525 in den Arbeitsablauf hat den Verbrauch von 2.312 Spitzen pro Sequenzierungslauf eingespart. Die Miniaturisierung der PCR-Reaktionen mit dem Echo ermöglichte es, 50% weniger RT-PCR Mastermix zu verbrauchen, ohne den Arbeitsablauf zu verändern.