Therapeutische Peptide – schnell und automatisiert hergestellt
Die automatisierte Lösung
Neue Fragestellungen der Proteomforschung, die zur Identifizierung von Zielpeptiden oder -proteinen geführt haben, können oft nur durch den Vergleich mit einer großen Anzahl verschiedener Peptide beantwortet werden. Diese werden in Milligramm-Mengen benötigt und können mit den automatisierten parallelen Synthesizern MultiPep 1 oder MultiPep 2 synthetisiert werden. Die automatisierte Festphasenpeptidsynthese (SPPS) bietet dafür eine geeignete Technologie zur Herstellung synthetischer Peptide. CEM hat die bewährten MultiPep Peptidsynthesizer von Intavis übernommen und entwickelt sie weiter als Ergänzung zu den Liberty Mikrowellen-Peptid-Synthesizern.
MultiPep 1 & 2 (Abb. 1) sind für die automatisierte Synthese von Peptiden in einem relativ kleinen Maßstab von wenigen Mikromol unter Verwendung der milden und bewährten Fmoc-Chemie ausgelegt. Konventionelle Synthesizer mit Einzelreaktoren sind nicht in der Lage, Hunderte von Peptiden parallel herzustellen, die für Screening-Experimente benötigt werden. Der MultiPep 2 kann bis zu 384 Peptide gleichzeitig in einem Synthesemaßstab von 1 bis 10 Mikromol synthetisieren. Die Synthesen werden entweder in Filterplatten im 96-Well-Format (Abb. 2) oder in Filtersäulen (Abb. 3) auf einem geeigneten Syntheseharz durchgeführt.
Für das Epitope-Mapping und Proteininteraktionsstudien können die SPOT- oder CelluSpots™-Module (Abb. 4) verwendet werden, die bis zu 2400 Peptide parallel synthetisieren. Wenn größere Mengen an Peptiden benötigt werden, kann ein optionales heizbares Säulenmodul mit Schüttler zur Synthese von bis zu 72 Peptiden in Maßstäben von 10 bis 300 Mikromol verwendet werden.
Die Peptide werden durch Synthese an fester Phase (SPPS) im Durchfluss in 96er Filterplatten oder Filtersäulen unter Verwendung der am häufigsten verwendeten Fmoc/tBu-Schutzgruppenstrategie auf derivatisierten Syntheseharzen synthetisiert. Die Chemie ist für die Fmoc-basierte Synthese mit Voraktivierung durch HBTU/NMM, Oxyma/DIC oder einem ähnlichen Protokoll optimiert. Die Fmoc-Aminosäurederivate werden mit Aktivator und Base gemischt, voraktiviert und mit dem präzise arbeitenden Dilutor verteilt.
Das vielseitige Softwarepaket ist vorkonfiguriert mit Standard Synthesemethoden und ermöglicht die einfache Erstellung von erweiterten und speziellen Syntheseprotokollen. Die gesamte Synthese wird in einer detaillierten Dokumentation in einem ZIP-Archiv gespeichert. Dazu gehört der Sequenzfile der Peptide, der berechnete Reagenzienverbrauch, die Synthesemethode und ein Log-File des zeitlichen Ablaufs.
Der MultiPep ist ein automatisierter multipler Peptid-Synthesizer, der auf einem Pipettierroboter mit einem Dilutor und einer weiteren Pumpe basiert, welcher von einer speziellen PC-Software (Win10) gesteuert wird. Die austauschbaren Module erlauben es, das Basisgerät in verschiedenen Konfigurationen für die Synthese von Peptidarrays, Peptid-Bibliotheken, modifizierten Peptide oder PNAs in kleinsten Mengen sowie für hochwertige Peptide in großem Synthesemaßstab zu nutzen. Der Synthesizer deckt die Anforderungen von Zentral-, Forschungslabors und kundenspezifischen Synthesehäusern ab. Der Wechsel zwischen den einzelnen Synthese-Modulen ist innerhalb von 30 Minuten erledigt. Bis zu 7 Lösungsmittelpositionen und 13 zusätzliche Reagenzflaschen garantieren die Flexibilität beim Betrieb komplexer Synthese-Protokolle.
Verfügbare Synthesemodule und allgemeine Funktionen:
1. Filtersäulen:
Zwei Synthesereaktionsblöcke für die parallele Synthese von bis zu 48 oder 72 Peptiden in Filtersäulen stehen zur Verfügung. Die Synthese-maßstäbe reichen von 10 bis 500 Mikromol.
2. Mini-Säulenmodul:
Parallele Synthese von bis zu 48 Peptiden in einzelnen Minisäulen in Synthesemaßstab von 1 bis 10 Mikromol.
3. Plattenmodul:
Parallele Synthese von bis zu 384 Peptiden in vier speziellen 96 well Filterplatten im Synthesemaßstab von 1 bis 10 Mikromol.
Peptidbibliotheken können in bis zu vier Filterplatten parallel synthetisiert werden. Für eine kleinere Anzahl modifizierter Peptide oder PNAs, eignet sich das Minisäulenmodul mit zwei unterschiedlichen Säulengrößen und bietet eine hohe Flexibilität.
4. SPOT-Synthesemodul:
Parallele Synthese von bis zu 2400 Peptiden auf 4 Membranen (600 Peptide pro Membran) zur Herstellung von Peptidarrays. Peptidarrays eignen sich für das Epitope-Mapping, Protein/Protein-Interaktionen oder Inhibitor-Studien. Der MultiPep eignet sich für die Synthese von membran-gebundenen Peptidarrays (SPOT-Methode) oder in Kombination mit dem Slide Spotting Robot zur Herstellung von Hunderten identischen Peptid-arrays auf beschichteten Objektträgern - CelluSpots™.
5. CelluSpots™ -Synthesemodul:
Parallele Synthese von bis zu 1536 Peptiden auf einzelnen Scheiben in 384-Well- Syntheseplatten. Dieses einzigartige Synthesemodul wird verwendet, um CelluSpots™ -Peptidarrays auf beschichteten Objektträgern herzustellen. Für das Spotten von Peptidkonjugaten auf die Objektträger wird ein zusätzlicher Spotter benötigt.
Auf den Synthesemodulen mit Filtersäulen können Reaktionen mit erhöhter Temperatur durchgeführt werden. Dies wird durch einen optionalen Heizblock mit softwareseitig einstellbarer Temperaturregelung erleichtert. Eine erhöhte Reaktionstemperatur während der Synthese ist hilfreich, um die Reinheit der Peptide bei schwierigen und längeren Peptid-Sequenzen zu verbessern.
Weiterhin werden diese Module mit einem zusätzlichen Schüttler ausgestattet.
Peptide für die personalisierte Therapie stellen eine synthetische Herausforderung dar, weil jeder Patient einen einzigartigen Satz an Peptiden benötigt, die sich in Aminosäurezusammensetzung und physiochemischen Eigenschaften unterscheiden. Die erfolgreiche Automatisierung der Peptidsynthese führte zu einem Durchbruch auf dem Markt für Peptidtherapeutika.
Werden im Tumor eines Patienten ein oder mehrere Neoantigene gefunden, sind individuelle Impfstoffe mit Peptiden eine vielversprechende Strategie für eine effektive Therapie. Jeder Tumor ist einzigartig und weist ein hochspezifisches Muster an genetischen Veränderungen auf, die sich zum Teil an der Zelloberfläche abbilden und für das Immunsystem erkennbar sind.
Ziel therapeutischer Impfstrategien mit Neoantigenen bei Krebs ist die Präsentation spezifischer Antigene des jeweiligen Tumors. Diese sollen die körpereigene Abwehr veranlassen, ihre volle Kraft auf die Tumorzellen zu richten und diese zu vernichten. Bei der Ausschaltung von Tumorzellen muss das Immunsystem unter verschärften Bedingungen arbeiten, denn Tumorzellen sind keine fremden Eindringlinge, sondern Zellen des eigenen Körpers, die normalerweise unbehelligt bleiben.
Die Anforderungen, die ein Neoantigen-Impfstoff zu erfüllen hat, erfordert viel von einem Peptidsynthesizer. Ein Impfstoff-Cocktail kann aus zehn oder mehr verschiedenen Peptiden (Länge: 15-25 AS) bestehen. Die MultiPep-Systeme eignen sich besonders für die parallele Synthese von Neoantigen. Der MultiPep 2 kann bis zu 72 unabhängige Peptidsequenzen parallel synthetisieren. Die Peptidsynthesizer von CEM sind mit ihren Mikrowellen basierten (Liberty) und Multiplen Synthesizern (MultiPep 1&2) prädestiniert diese Aufgabe in der Wirkstoffentwicklung zu erfüllen.
Literatur:
1. Peptide chemistry toolbox - Transforming natural peptides into peptide therapeutics
Miloš Erak, Kathrin Bellmann-Sickert, Sylvia Els-Heindl, Annette G. Beck-Sickinger
Bioorganic & Medicinal Chemistry, Volume 26, Issue 10, 1 June 2018, Pages 2759-2765
2. Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends, and future directions
Jolene L. Lau, Michael K. Dunn ⇑
Bioorganic & Medicinal Chemistry, Volume 26, Issue 10, 1 June 2018, Pages 2700-2707
3. Peptide Therapeutics 2.0
Beatriz G. de la Torre and Fernando Albericio
Molecules 2020, 25, 2293; doi:10.3390/molecules25102293
