NIS-Seq bringt Genomsequenzen zum Leuchten

Könnten Zellen selbst anzeigen, dass sie veränderte Gensequenzen tragen, ließen sich an der Entstehung von Krankheiten beteiligte Gene viel einfacher finden. Ein Bonner Forschungsteam hat nun eine Methode für ein solches optisches CRISPR-Screening entwickelt. Seine Methode des Nuclear In-Situ Sequencing (NIS-Seq) ermöglicht es, beliebige Prozesse in lebenden Zellen zu verfolgen und die daran beteiligten Gene zu bestimmen.

„Wir sind überzeugt davon, dass unsere Methode der neue Standard für die Identifikation von genetischen Schlüsselakteuren zellulärer Prozesse wird“, so der Seniorautor Jonathan Schmid-Burgk selbstbewusst, der an der Universität Bonn und am Universitätsklinikum Bonn forscht.

Bei der im Fachjournal Nature Biotechnology vorgestellten NIS-Seq-Methode wird neben der sgRNA für die CRISPR-Cas9-Genomeditierung ein T7-Phagenpromotor in den Zellkern eingeschleust. Dieser vervielfältigt die CRISPR-Barcode-Sequenzen und bringt sie in drei Farben zum Leuchten. Mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie können die Farbpunkte im Zellkern über mehrere Amplifikationszyklen hinweg verfolgt werden. So lässt sich die Sequenz des ausgeschalteten Gens direkt aus den Fluoreszenzsignalen ablesen.

Im Vergleich zu herkömmlichen CRISPR-Screenings, die oft Monate dauerten, benötige man laut den Autoren für die Identifikation eines relevanten Gens mit NIS-Seq nur rund eine Woche. Während bei traditionellen Methoden zunächst in jeder Zelle ein zufälliges Gen ausgeschaltet und dann die veränderten Zellen über Techniken wie FACS, Massenspektrometrie oder RNA-Sequenzierung angereichert werden müssen, ist der NIS-Seq-Prozess schneller und direkter. Zudem besteht bei herkömmlichen Methoden das Risiko, dass nicht alle Zelltypen den langwierigen Prozess überleben.

NIS-Seq stellt eine Weiterentwicklung der In-situ-Sequenzierung dar, bei der die Barcode-Amplifikation bislang im Zytosol stattfindet. Der Nachteil der ursprünglichen optischen Screening-Methode ist, dass sie bei kleinen oder transkriptionell inaktiven Zellen nur schwache Signale erzeugt. NIS-Seq erfordert zudem keine Permeabilisierung, wodurch die Zellgrenzen erhalten bleiben und eine präzisere Zuordnung der Zellen möglich wird. Dies macht die Methode besonders zuverlässig – auch bei hoher Zelldichte und dynamischen Prozessen.

Die mikroskopische Analyse ermöglicht es, die Beziehung zu einer Vielzahl von Zellphänotypen zu untersuchen. Zur Demonstration der vielfältigen Anwendungsgebiete führte das Forschungsteam vier genomweite optische Screens – unter anderem in humanen Primärzellen und Makrophagen – durch und konnte auf diese Weise erfolgreich Schlüsselgene der Entzündungsantwort sowie der angeborenen Immunantwort identifizieren.