Guide-RNA sequenzieren

Das CRISPR-Cas-System ist spätestens seit dem Nobelpreis im Jahr 2020 von Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna in den Fokus der biotechnologischen und pharmazeutischen Industrie gerückt. Die gezielte Manipulation von Genen birgt eine Fülle von Möglichkeiten in quasi allen Bereichen des Lebens. Angefangen von robusteren Pflanzen, die dem Klimawandel trotzen, bis hin zu langersehnten therapeutischen Optionen für schwere Erkrankungen. Damit das CRISPR-Cas-System seine Wirkung entfalten kann, ist eine exakte Sequenzabfolge dieser meist synthetischen Oligonukleotide äußerst wichtig. Ohne die korrekte Sequenzabfolge kann weder die Bindung an die Ziel-DNA noch die Rekrutierung des­ ­Enzyms Cas9 stattfinden. Klassischerweise wurde die Sequenzbestimmung für reine RNA-Verbindungen über Sanger-Sequenzierung oder Next Generation Sequencing durchgeführt. Da die Oligonukleotid-Gemeinschaft bereits früh feststellte, dass gewisse Modifikationen der Stabilität der Moleküle zuträglich sind, sind auch die single guide RNAs (sgRNAs) nicht mehr nur reine RNA-Moleküle. Diese Modifikationen können durch die genannten Methoden nicht abgebildet werden.

Tandem-MS
In der Proteinforschung ist bereits seit Langem (Tandem)-Massenspektrometrie die Methode der Wahl, um die Identität der Proteine und ihre posttranslationalen sowie chemischen Modifikationen zu untersuchen. Auch für kürzere Oligonukleotide wurde diese Technik schnell und erfolgreich adaptiert. Längere Oligonukleotide, wie die sgRNA mit circa 100 Nukleotiden Länge, sind eine Herausforderung. Damit diese Moleküle dennoch vermessen werden können, wurden verschiedene Techniken etabliert, um die Identität eindeutig zu bestätigen. Die einfachste und mit Sicherheit auch naheliegendste Technik ist die Top-Down-Technik, bei der versucht wird, das Molekül direkt der Tandem-MS-Messung zuzuführen. Da sgRNA im Vergleich zu anderen Oligonukleotiden sehr groß ist, kann nur mit neuester MS-Technologie eine Sequenzbestätigung – von etwa 80% – erreicht werden. Erfolgreicher ist aber ein von Goyon et. al. 2021 entwickeltes Verfahren was der Bottom-Up-Analytik gleicht. Hierbei wird die sgRNA durch RNAsen in kleinere Stücke verdaut und diese vermessen, ähnlich den klassischen Proteomikansätzen. Beim neuesten, genauesten Middle-Down-Ansatz, entstehen Produkte, die zwischen den beiden zuvor genannten Ansätzen liegen. Generell sind alle Ansätze für die Identitätsbestimmung geeignet; es wird aber noch einige Forschung und Entwicklung benötigen, um eine neue Standardmethode zu etablieren.

Dieser Beitrag wurde |transkript 3/2023 entnommen.