RNA-Kassettenrekorder: Ein molekulares Gedächtnis für die Zelle

Wer verstehen will, wie eine Zelle auf einen Reiz reagiert, muss mehr wissen als die Momentaufnahme ihrer Genaktivität. Viele Gene werden nur vorübergehend angeschaltet. Ihre Boten-RNAs entstehen, werden in Proteine übersetzt und anschließend wieder abgebaut. Wird die Zelle erst später untersucht, kann der ursprüngliche Vorgang im üblichen RNA-Sequenzierungsprofil bereits unsichtbar sein.

Ein Forschungsteam um Randall J. Platt von der ETH Zürich am D-BSSE in Basel stellt in Nature Biotechnology nun eine Methode vor, die solche flüchtigen Signale länger verfügbar macht. Das sogenannte „Recordanelle“ sammelt Boten-RNAs in einem künstlich erzeugten, intrazellulären Speicher und schützt sie vor dem Abbau. So lässt sich auch nachträglich untersuchen, welche Gene zuvor aktiv waren. Die Forscher demonstrieren dies unter anderem an einer vorübergehenden Immunantwort in menschlichen Zellen.

Drei Bausteine bilden das RNA-Archiv

Das Recordanelle, der synthetische Kassettenrekorder, ist kein natürlich vorkommendes Organell und auch kein klassisches, von einer eigenen Membran umschlossenes Zellkompartiment. Es handelt sich vielmehr um ein synthetisches Proteinsystem, das an der Oberfläche der Mitochondrien verankert wird. Es entsteht durch die Expression eines einzelnen künstlich konstruierten Fusionsproteins, das drei funktionelle Komponenten vereint.

Der erste Baustein ist ein mitochondrialer Anker. Die Forscher um Platt verwenden dafür die ersten 70 Aminosäuren des menschlichen Proteins TOM20. Dieser Abschnitt sorgt dafür, dass das Fusionsprotein an der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert. Die Mitochondrien dienen damit als räumlicher Bezugspunkt für den Speicher und erleichtern später dessen Anreicherung bei der Aufarbeitung der Zellen.

Der zweite Baustein ist ein Assembler, im optimierten System ein Abschnitt des Proteins TAF15, bezeichnet als TAF15N. Er fördert die Bildung eines biomolekularen Kondensats. Solche Kondensate sind Ansammlungen von Molekülen, die sich durch zahlreiche schwache Wechselwirkungen zusammenlagern können, ohne von einer eigenen Lipidmembran umschlossen zu sein. Vereinfacht gesagt entsteht so eine lokale, proteinreiche Umgebung, in der RNA-Moleküle angereichert werden können.

Der dritte Baustein ist ein RNA-Bindungsprotein. In der leistungsfähigsten beschriebenen Variante, Recordanelle V2, setzen die Forschenden eine modifizierte Form des Poly(A)-Bindungsproteins PABPC4 ein, bezeichnet als PABPC4deltaC161A. Dieses Protein bindet an den Poly(A)-Schwanz vieler zellulärer Boten-RNAs. Der Poly(A)-Schwanz besteht aus einer Kette von Adenosin-Nukleotiden am Ende der meisten reifen, protein-codierenden mRNAs und ist unter anderem an ihrer Stabilität und ihrem Transport beteiligt.

Entscheidend ist das Zusammenspiel der drei Komponenten: Der mitochondriale Anker positioniert das System, der Assembler schafft eine kondensierte Umgebung und das Bindungsprotein rekrutiert RNA. Das Recordanelle sammelt dabei nicht einfach wahllos sämtliche Moleküle in seiner Umgebung. Die Auswahl hängt unter anderem davon ab, welche RNAs das Bindungsprotein erkennt und wie die einzelnen Komponenten zusammenwirken.

Die Forscher testeten verschiedene Kombinationen dieser Bausteine. Sie zeigten auch, dass sich das System für einzelne, gezielt ausgewählte RNA-Moleküle programmieren lässt: Dazu können beispielsweise virale RNA-Bindungsproteine verwendet werden, die bestimmte künstlich eingefügte Sequenzschleifen erkennen. Für die breitere Erfassung des zellulären Transkriptoms erwies sich dagegen die Bindung an Poly(A)-Schwänze als besonders geeignet.

Was bedeutet „Recording“ tatsächlich?

Der Begriff „Recording“ kann den Eindruck erwecken, die Zelle schreibe ihre Vergangenheit in ein molekulares Logbuch. Genau das geschieht hier nicht. Das Recordanelle speichert nämlich keine Zeitstempel, stattdessen nutzt das System einen biologischen Umstand: Boten-RNAs sind vergängliche Moleküle. Wird ein Gen aktiviert, kann seine mRNA nach einiger Zeit wieder verschwinden. Wird ein Teil dieser mRNA jedoch vom Recordanelle eingefangen und vor dem Abbau geschützt, bleibt sie länger nachweisbar als im übrigen Zellplasma.

Das Archiv ist damit eine zeitlich verzögerte molekulare Momentaufnahme mit Gedächtniswirkung. Es integriert Signale über einen Zeitraum, statt nur den Zustand zum Zeitpunkt der Probenentnahme abzubilden. Weil fortlaufend neue RNA aufgenommen wird und ältere Moleküle verloren gehen können, ist es allerdings kein unbegrenzt wachsendes Archiv. Die Forschenden sprechen deshalb von kontinuierlicher RNA-Aufzeichnung, nicht von einer lückenlosen Chronik.

Wie lässt sich das gespeicherte Signal auslesen?

Das Recordanelle ist nicht selbst der Detektor. Es bewahrt die Moleküle, die anschließend mit etablierten molekularbiologischen Verfahren analysiert werden. Der Auslesevorgang besteht im Wesentlichen aus drei Schritten.

Zunächst werden die Zellen aufgeschlossen und die mitochondriale Fraktion angereichert. Weil das Recordanelle an der äußeren Mitochondrienmembran sitzt, enthält diese Fraktion auch die angereicherten RNA-Moleküle. Sie ist allerdings nicht mit einem vollständig isolierten, reinen Recordanelle gleichzusetzen: Die mitochondriale Fraktion umfasst weitere Bestandteile, weshalb Kontrollen und Vergleichsmessungen notwendig sind.

Anschließend wird die RNA aus der Fraktion extrahiert. Für einzelne Zielgene können die Forschenden beispielsweise eine quantitative PCR (qPCR) verwenden. Dabei wird gemessen, wie viel von einer bestimmten RNA im Vergleich zu Kontrollbedingungen noch vorhanden ist. So lässt sich prüfen, ob ein zuvor gesetzter Reiz später noch als RNA-Signal erkennbar ist.

Für eine breitere Analyse wird die RNA sequenziert. Bei der RNA-Sequenzierung (RNA-seq) werden die RNA-Moleküle in eine sequenzierbare Form überführt und ausgelesen. Die erhaltenen Sequenzen werden Genen zugeordnet und quantitativ ausgewertet. Vergleicht man das Profil aus der mitochondrialen Fraktion mit dem RNA-Profil der gesamten Zelle und mit geeigneten Kontrollbedingungen, lässt sich bestimmen, welche Transkripte im Recordanelle angereichert sind. Das erlaubt Rückschlüsse darauf, welche Gene während des zurückliegenden Beobachtungszeitraums aktiv waren.

Die Methode kann auch auf Einzelzellebene eingesetzt werden. Dazu werden die RNA-Signale einzelnen Zellen zugeordnet und ihre Expressionsprofile bioinformatisch verglichen. Die Forschenden können so untersuchen, ob eine frühere Stimulation in vielen Zellen ein ähnliches Muster hinterlassen hat oder ob sich eine Untergruppe von Zellen durch ein charakteristisches Genexpressionsprofil auszeichnet. Das Recordanelle liefert dabei die verlängerte Nachweisbarkeit der RNA; die Einzelzellsequenzierung und die anschließende Datenanalyse machen die Unterschiede zwischen den Zellen sichtbar.

Immunantwort bleibt über Tage erkennbar

Die Studie demonstriert das Prinzip zunächst mit einem künstlich steuerbaren Reportergen. Die Forscher aktivierten die Produktion einer markierten mRNA vorübergehend und untersuchten, ob das Recordanelle sie auch nach Ende der Stimulation noch bewahren konnte. Die leistungsfähigeren Varianten schützten die RNA über mindestens 48 Stunden.

Anschließend untersuchte das Team eine biologische Reaktion: menschliche HEK293T-Zellen wurden 20 Stunden lang mit Interferon beta (IFN-ß) stimuliert. Dieses Zytokin aktiviert ein Netzwerk von Genen, die an der antiviralen Immunantwort beteiligt sind. Nach Entfernung des Stimulus wurden die Zellen weiterkultiviert und zu späteren Zeitpunkten analysiert.

Ohne funktionierendes RNA-Archiv war das Signal der untersuchten interferonstimulierten Gene nach zwei Tagen weitgehend verschwunden. Mit Recordanelle V2 blieb dagegen ein charakteristisches RNA-Muster nachweisbar. In der Auswertung der mitochondrialen Fraktion fanden die Forschenden auch zwei Tage nach Ende der Stimulation noch die zuvor induzierten Gene. Bei der Analyse einzelner Zellen ließ sich zudem eine Gruppe identifizieren, deren Genexpressionsprofil die frühere Interferonreaktion widerspiegelte.

Unter Bedingungen ohne Zellpassage blieb das Signal sogar mindestens fünf Tage nach der Stimulation nachweisbar. Wurden die Zellen geteilt und weiterkultiviert, nahm die Nachweisbarkeit schneller ab.

Bis zu 90 Prozent der exprimierten Gene erfasst

Bei der breiten Erfassung zellulärer mRNA zeigte die optimierte Recordanelle-Variante eine Anreicherung für bis zu 90 Prozent der in den untersuchten HEK293T-Zellen nachweisbaren Gene.

Die Autoren berichten außerdem, dass sie unter den untersuchten Bedingungen keine wesentlichen Veränderungen des gesamten zellulären Transkriptoms oder Proteoms und keine deutlichen Beeinträchtigungen der untersuchten mitochondrialen Funktionen feststellten. Daraus folgt jedoch nicht, dass das System die Zellbiologie grundsätzlich unbeeinflusst lässt. Die Expression eines zusätzlichen Proteins, die Besetzung der Mitochondrienoberfläche und die Bindung von RNA können biologische Prozesse verändern. Die Autoren weisen selbst darauf hin, dass sich solche Effekte nicht vollständig ausschließen lassen.

Ein Archiv, aber keine exakte Chronologie

Die neue Methode erweitert die Möglichkeiten, dynamische Vorgänge in Zellen retrospektiv zu untersuchen. Sie könnte etwa helfen, seltene oder vorübergehende Zustände in Zellpopulationen aufzuspüren, Reaktionen auf Wirkstoffe zu vergleichen oder Unterschiede zwischen einzelnen Zellen nach einem gemeinsamen Reiz zu erkennen.

Ihre Grenzen liegen zugleich im Prinzip des Verfahrens. Die gespeicherten RNA-Mengen sind kein direkter Zeitstempel: Aus einem späteren Sequenzprofil allein lässt sich nicht exakt ablesen, wann ein bestimmtes Gen aktiv war oder wie lange die Aktivierung dauerte. Auch sind die aufgenommenen Transkripte eine Auswahl und keine vollständige, unverzerrte Kopie sämtlicher RNA-Moleküle. Bindungspräferenzen, RNA-Stabilität, Zellzustand und Zellteilung beeinflussen, welche Signale wie lange erhalten bleiben.

Das Recordanelle ist deshalb weniger ein molekularer Flugschreiber als ein biologisches Archiv, das flüchtige Spuren länger lesbar macht. Sein Wert liegt darin, dass Forscher die Vergangenheit einer Zelle nicht mehr ausschließlich aus dem RNA-Zustand zum Zeitpunkt der Probenentnahme erschließen müssen. Wie genau sich aus diesem Archiv zeitliche Abläufe und kausale Zusammenhänge rekonstruieren lassen, muss in weiteren Anwendungen geklärt werden.